14.08.2012
Специфическая лабораторная диагностика парентеральных вирусных гепатитов
Основой постановки диагноза «вирусный гепатит» служат знания о его возбудителе, его репликации, информации о появлении и исчезновении маркеров инфицирования, а также современные иммунохимические и молекулярно-биологические методы детекции антигенов, антител и нуклеиновых кислот.
Серодиагностика вирусного гепатита В
Рисунок 1. Структура
вируса гепатита ВВирус гепатита В (HBV) относится к семейству Hepadnoviridae. Геном вируса представлен частично сдвоенной кольцевой молекулой ДНК размером 3200 п.н. При световой микроскопии HBV выглядит сферической частицей диаметром 42 нм (частица Дейна), состоящей из ядра - нуклеоида, имеющего форму икосаэдра диаметром 28 нм, внутри которого находится двуцепочечная ДНК, концевой белок и фермент ДНК-полимераза. В состав нуклеоидного белка входят HBcAg и HBeAg. Внешняя оболочка (толщиной 7 нм) образована поверхностным антигеном HBV – HBsAg (рис.1). Вирус гепатита В является псевдоретровирусом, т. е. его ДНК может частично встраиваться в геном гепатоцитов.
Основой лабораторной диагностики HBV инфекции является определение серологических маркеров инфицирования вирусом: HBsAg, HBeAg, анти-НВс класса IgM и IgG, анти-НВе и анти-HBs, HBV ДНК и активности вирусной ДНК - полимеразы. В зависимости от течения вирусного гепатита В спектр изменения серологических маркеров выглядит по-разному.
Рисунок 2. Спектр изменения
серологических маркеров
при вирусном гепатите ВПервым серологическим маркером вируса, обнаруживаемым в сыворотке крови, является
HBsAg. Этот антиген достигает доступных для детекции концентраций спустя 6 недель после внедрения вируса в организм человека и продолжает персистировать в крови человека от нескольких недель до нескольких месяцев. Длительное (свыше 6 месяцев после появления первых клинических симптомов заболевания) выявление HBsAg в сыворотке крови свидетельствует о формировании хронической инфекции. Поверхностный антиген вируса гепатита В является маркером как острой, так и хронической инфекции. В последнее время все большее внимание привлекает так называемая скрытая, или латентная, инфекция, вызванная вирусом гепатита В. Это феномен, при котором имеет место персистирование вируса, однако HBsAg в сыворотке крови пациентов не определяется. Следует подчеркнуть, что в настоящее время в лечебно-диагностических учреждениях и центрах сбора крови HBsAg остается основным маркером инфицирования вирусным гепатитом В. Поэтому определение ДНК вируса с целью установления латентной инфекции приобретает все большее значение. Причинами, по которым в сыворотке крови пациентов может выявляться ДНК вируса при отсутствии HBsAg, могут быть:
- совпадение времени исследования с фазой «серологического окна», когда HBsAg уже не определяется, а концентрация анти-НВs еще не достигла необходимого уровня для выявления его коммерческими тест-системами;
- формирование циркулирующих иммунных комплексов «HBsAg/ анти-НВs»;
- супрессия синтеза HBsAg при ко-инфицировании вирусом гепатита С, ВИЧ и другими вирусами;
- наличие «ускользающего» (мутантного) варианта вируса, HBsAg которого не выявляется коммерческими тест-системами.
Наиболее чувствительным показателем вирусной репликации является выявление
ДНК вируса гепатита В в крови. Исследование на наличие ДНК в сыворотке крови имеет большое значение при обследовании контактных лиц с целью наиболее раннего выявления инфекции. ДНК вируса гепатита В обнаруживается при любых формах инфекции. Определение вирусной нагрузки (концентрация ДНК вируса гепатита В в крови) является важным параметром при определении показаний к лечению и контроля его эффективности.
HBeAg – вирусспецифический белок, является отдельным антигеном вируса. При острой инфекции, которая завершается выздоровлением, HBeAg появляется в сыворотке крови вслед за поверхностным белком вируса и перестает обнаруживаться до исчезновения HBsAg. При хронической инфекции HBeAg присутствует в крови длительные сроки, свыше 6 месяцев. Обнаружение HBeAg в сыворотке крови служит косвенным доказательством активной вирусной репликации.
HBсAg – сердцевинный антиген, обнаруживается только в ткани печени, поэтому практического значения этот маркер не имеет.
Большую диагностическую значимость имеют антитела к этому антигену (анти-НВс).
Анти-НВс начинают определяться в крови после появления первых клинических симптомов заболевания. Маркером ранней инфекции являются
анти-НВс класса IgM. Определение их является одним из достоверных серологических критериев острого вирусного гепатита В.
Анти-HBc IgM выявляются через 1-2 недели после обнаружения HBsAg и сохраняются на протяжении 2-18 месяцев. У 4-20 % больных острым гепатитом В анти-HBc IgM являются единственным маркером инфекции. При хроническом вирусном гепатите В анти-НВс IgM могут быть выявлены у некоторых больных в меньших титрах, чем при острой инфекции, причем титр антител отражает тяжесть гепатита.
Анти-HBc IgM постепенно замещаются
анти-НВс класса IgG. Антитела этого класса удается обнаружить как у больных острым гепатитом В на различных стадиях инфекционного процесса, так и у больных хроническим вирусным гепатитом В, а также у лиц, перенесших в прошлом гепатит В и выздоровевших. Интерпретацию результатов в тестируемом образце проводят только с учетом выявления других маркеров инфекции.
Антитела к HBsAg (
анти-НВs) свидетельствуют о ранее перенесенной инфекции или о наличии поствакцинального иммунитета (защитный уровень - 10 МЕ/мл). Они появляются в период выздоровления, через 4 недели после исчезновения HBsAg, достигая максимальной концентрации через 1-2 года, с последующим постепенным снижением уровня, недоступного выявлению современными методами диагностики. Анти-HВs обычно персистируют длительно, возможно в течении всей жизни. Появление анти-HBs на фоне клинического улучшения у больного гепатитом В является хорошим прогностическим признаком. Важно отметить, что в динамике острой инфекции HBV имеется "окно", когда HBsAg уже не определяется, а анти-HBs еще не появились. При этом выявляются анти-HBc IgM и IgG. Из этого следует вывод о необходимости обследования больных ОВГ на анти-HBc IgM даже при отрицательных результатах исследования HBsAg и анти-НВs.
Антитела к HBeAg (
анти-НВе) появляются в крови после элиминации HBeAg и завершения репликации вируса. К концу 9-й недели острого периода гепатита В более 90% больных имеют анти-НВе. В период выздоровления анти-НВе могут исчезать. Однако, наличие анти-НВе не является показателем отсутствия инфекционности конкретной сыворотки крови. Показано, что у ряда больных в ходе развития гепатита В (около 10%) под влиянием "иммунного давления" на вирус возникают мутантные формы, которые "избегают" иммунного надзора и не элиминируются. У носителей анти-HBe был выделен мутант, неспособный продуцировать HBeAg из-за дефектов в области precore и получивший обозначение HBeAg-отрицательного. Появление HBeAg-отрицательного мутанта приводит к прогрессированию поражения печени при продолжающейся репликации вируса (наличие ДНК HBV в сыворотке крови). При первичном инфицировании HBeAg-отрицательным мутантом существенно возрастает риск развития фульминантного гепатита.
Вирусный гепатит В имеет свой серологический профиль (табл.1). Характер появления и исчезновения маркеров инфицирования зависит от наличия у больного «дикого» или «мутантного» вируса гепатита В. При инфицировании «диким» штаммом вируса после завершения острого гепатита В сохраняется синтез HBsAg. Выявляются показатели репликации вируса: HBeAg и ДНК HBV). Анти-НВс циркулируют параллельно с HBsAg. Титры IgM к HBeAg могут колебаться, однако они ниже, чем при остром гепатите В. Интегративная фаза хронического гепатита В характеризуется прекращением синтеза HBeAg и через фазу «окна» по HBeAg/ анти-НВе регистрируют анти-НВе. При заражении или появлении мутантного по pre-core зоне ДНК вируса гепатита В регистрируется иной серологический профиль. Точечная мутация вируса гепатита В вызывает прекращение синтеза HBeAg, что ведет к более активной атаке на гепатоциты. На протяжении всего течения хронического гепатита, при наличии анти-НВе, чередуются подъемы и спады активности сывороточных трансаминаз. Параллельно происходит репликация ДНК вируса и выявление анти-НВс IgM. Установлено, что частота формирования цирроза печени у больных хроническим гепатитом В с серологическим профилем «анти-НВе+/ДНК HBV+» выше, чем у больных, инфицированных «диким» штаммом (HBeAg+/ ДНК HBV+) (Турьянов, 1999).
Таблица №1. Основные маркеры гепатита В при различных клинических формах. Клиническая форма
HBsAg
HBeAg
Анти-HBc IgM
Анти-HBc сумм.
Анти-НВе
Анти-HВs
ДНК HBV
Острый гепатит В, «дикий» штамм
+
+
+
+
-
-
+
Острый гепатит В, «мутантный» штамм
+
-
+
+
-
-
+
Острый гепатит В разрешившийся; Сероконверсия
+
-
+/-
+
+
-
-/+
Хронический гепатит В активный
+
+
+/-
+
-/+
-
+
Хронический гепатит В интегративный
+/-
-/+
-/+
+
+/-
-
+/-
«Здоровое» носительство
+
-
-
+
-
-/+
-
Перенесенный вирусный гепатит В
-
-
-
+
-/+
+
-
Состояние после иммунизации
-
-
-
-
-
+
-
Для выявления антигенов и антител возбудителя используются тест-системы, основанные на принципах иммуноферментного анализа (ИФА) или хемилюминисцентного анализа (ХЛА). Недостатком данных методов является невозможность его использования при заражении мутантными формами вируса, при иммуносупрессии (больные онкологическими заболеваниями, наркоманы и т.д.) и для количественной оценки присутствующего в организме возбудителя. Решение этих задач стало возможным в результате внедрения молекулярно-биологических методов в практику клинико-диагностических лабораторий. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) существенно расширяет возможности лабораторной диагностики вирусного гепатита В, позволяя непосредственно выявить возбудитель, установить тканевую и внутриклеточную локализацию HBV, выявить и охарактеризовать мутантные формы вируса, оценить уровень виремии в течение заболевания, в том числе - на фоне противовирусной терапии.
Серодиагностика вирусного гепатита С
Рисунок 3. Структура вируса гепатита СВирус гепатита С (HCV) является РНК содержащим гепатотропным и лимфотропным вирусом, относящимся к семейству Flaviviridae. Геном вируса представлен одноцепочечной молекулой РНК размером около 9500 оснований, кодирующей структурные и неструктурные белки
К структурным белкам относят белок сердцевины и гликопротеины оболочки. Неструктурную область представляет комплекс белков с ферментативной активностью, в первую очередь РНК-зависимая - РНК полимераза. Помимо вирусных белков, снаружи вирион покрыт липидной оболочкой, состоящей из липопротеинов организма хозяина (рис.3).
Лабораторная диагностика была решена при помощи современных методов молекулярной биологии, учитывая, что при гепатите С вирус находится в крайне низкой концентрации и его антигены не доступны выявлению с помощью современных методов индикации, усилия исследователей сосредоточены на выявлении антител к различным антигенным компонентам вируса, обнаружение которых может служить индикатором наличия вируса. В качестве антигенов использовали белки, кодированные структурной и неструктурной зоной РНК-ВГС, полученные при помощи рекомбинантной технологиии или синтеза (полипептиды, используемые в современных иммунологических методах – С22-3; С33с, С100-3, С200, NS5, S-1-1).
Лабораторная диагностика гепатита С основывается на обнаружении серологических маркерв НСV: антител к вирусу гепатита С (анти-HCV, анти-HCV класса IgМ, IgG) методом ИФА и РНК HCV методом ПЦР. К настоящему времени разработаны 4 поколения тест-систем для выявления анти-HCV в иммуноферментном методе, но ИФА первого поколения сейчас не используется из-за низкой чувствительности.
РНК HCV является показателем активной репликации вируса гепатита С и самым ранним маркером инфекции, и может быть обнаружена методом ПЦР уже через 1- 2 недели после инфицирования, незадолго до повышения уровня сывороточных трансаминаз.
Анти-HCV обнаруживаются к 5-6 неделе после начала гепатита в 80% случаев и к 12 неделе у 90% лиц методом ИФА. При определении анти-HCV в некоторых случаях регистрируется ложноположительная реакция. Для разграничения ложноположительных образцов от образцов действительно содержащих антитела к вирусу, разработаны дополнительные тесты – рекомбинантный иммуноблотинг, определение спектра белков анти-HCV.
Спектр анти - HCV может различаться в зависимости от периода острого гепатита. Первым удается определить антитела, кодированные core и NS5 зонами РНК вируса. Анти-HCV к белкам, кодированным NS4 зоной, в острую фазу гепатита С отсутствуют.
Выявление РНК HCV считается «золотым» стандартом в диагностике гепатита С и подтверждением положительных результатов обнаружения анти-HCV. В настоящее время для индикации РНК HCV используется ПЦР в качественном и количественном варианте. Чувствительность методов определения РНК HCV повышается с каждым годом, достигая в настоящее время 10-50 копий РНК в 1 мл крови. Диагноз хронического гепатита С у лиц с наличием анти-HCV обычно ставится на основании повышенных печеночных проб в течение более 6 месяцев.
Особенность вируса гепатита С – высокая изменчивость, не только в пределах различных стран, но и у одного и того же больного на протяжении заболевания. В мире наиболее распространены пять генотипов вируса гепатита С – 1а, 1в, 2а, 2в, 3а. Определение принадлежности вируса гепатита С к тому или иному генотипу (субтипу) необходимо для решения не только научных, но и практических вопросов. В настоящее время в большинстве случаев для генотипирования РНК вируса применяются методы, основанные на проведении ПЦР с использованием типоспецифических праймеров.
Серодиагностика вирусного гепатита D
Вирус гепатита D (HDV) – сферическая частица размерами от 28 до 39 нм, по своей организации и морфологической структуре подобная вирусу гепатита В, но с менее четко отграниченным ядром. Нуклеиновая кислота вируса – однонитевая циклическая молекула РНК, негативной полярности, протяженностью около 1700 неклеотидов. Дельта-агент считают вирусом, но не относят ни к одному из известных семейств. В настоящее время его рассматривают как единственного представителя нового рода Deltavirus.
Лабораторная диагностика осуществляется путем обнаружения серологических маркеров HDV, включая наличие антигена, антител к нему и РНК HDV. Обнаружение антигена HDV и РНК HDVв сыворотке крови или ткани печени свидетельствует о наличии активной HDV-инфекции, однако, следует отметить, что эти маркеры могут не обнаруживаться в сыворотке больных фульминантным гепатитом D. Маркером активной репликации HDV также является анти-HDV класса IgМ. Серологические маркеры инфекции зависят от того, как был приобретен вирус – в виде коинфекции с HBV (у большинства больных заболевание имеет острое течение и заканчивается выздоровлением) или суперинфекции у больных с хронической HBV-инфекцией (протекает тяжелее, чем коинфекция - в 10% развивается фульминантный гепатит). При коинфекции в большинстве случаев антитела - анти-HDV класса IgМ и IgG - обнаруживаются в течение заболевания. Титр анти-HDV обычно снижается до практически неопределяемых уровней после выздоровления, и не сохраняется никаких серологических маркеров того, что человек был когда-либо инфицирован HDV. Антиген HDV определяется только у 25% больных и обычно исчезает вместе с исчезновением HВsAg. При суперинфекции у больных с хронической HBV-инфекцией серологическая картина имеет следующие характерные особенности: – титр HBsAg снижается к моменту появления антигена HDV в сыворотке; - антиген HDV и РНК-HDV продолжают определяться в сыворотке, так как обычно у большинства пациентов с суперинфекцией гепатита D(70-80%) развивается хроническая инфекция, в отличие от случаев коинфекции; - определяются высокие титры антител (анти-HDV) как класса IgМ, так и IgG, которые сохраняются неопределенное время. Серологические маркеры вируса гепатита D определяют методом иммуноферментного и радиоиммунного анализа, а РНК-HDV - методом полимеразной цепной реакции.
Перед лабораторным работником стоит четкая задача – предоставить объективную информацию о выявленном спектре вирусных антигенов и антител, а также нуклеиновых кислот вирусов, отвечающих за развитие гепатита.
Однако, при постановке диагноза «вирусный гепатит» необходимо учитывать не только наличие или отсутствие маркеров инфицирования вирусом, но и показатели активности «печеночных» ферментов, данные эпидемиологического анамнеза, результаты клинического осмотра пациента. Только комплексный учет перечисленных факторов позволяет с высокой степенью надежности диагностировать это заболевание.
Для лабораторной диагностики вирусных гепатитов необходимо произвести забор крови из вены. Для исключения ложноположительных результатов кровь на маркеры лучше исследовать в специализированной лаборатории. Рекомендуем обратиться к нам, в Аккредитованный Испытательный лабораторный центр ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Кировской области». Мы используем передовые методы диагностики, делающие процесс более простым и быстрым. Поэтому наши цены доступны для всех категорий населения. Не волнуйтесь! Все процедуры производятся специалистами с помощью современных одноразовых стерильных инструментов. Делать анализ крови в нашей лаборатории не больно и совершенно безопасно!
Мы ждем Вас по адресу: 610000, г. Киров, ул. Свободы, 64А, корпус №3; http://www.sanepid.ru; e-mail:dez@sanepid.ru; телефон: (8332) 38-19-16, 38-20-98.
