Новости ::

Место ПЦР в диагностике гепатитов

Шиттер С.В.

(Приморский краевой диагностический центр, зав. клинико-диагностической лабораторией), г. Владивосток


Под диагностикой гепатитов имеется в виду прежде всего гепатит С. Во-первых, его маркерами являются антитела, так как на сегодня в России отсутствуют коммерческие тест-системы для определения антигенов. Во-вторых, выработка антител часто имеет индивидуальные особенности, что не позволяет в достаточной мере стандартизовать оценку получаемых результатов. В третьих, качество диагностических наборов зачастую оставляет желать лучшего.

Согласно паспортным данным, чувствительность и специфичность тест-систем для ИФА превышает 95 %. Тест-системы для ПЦР по специфичности достигают 98 %, по чувствительности - менее 1000 геномов на пробу.

На первый взгляд неплохие показатели. Однако приведу конкретные цифры. На базе нашей лаборатории обследовано на гепатиты методом ИФА 1090 человек, методом ПЦР - 1274. При упомянутых характеристиках, количество выданных заведомо неправильных результатов должно составить для ИФА 54 человека, для ПЦР - 25 человек. Эти цифры верны лишь для ПЦР, где используется одна методика. ИФА - диагностика гепатита С на сегодня использует 6 маркеров. Даже параллельное использование двух методик снижает вероятность ошибки до 2,5 на 1000, что для нашей выборки означает неправильные результаты у 2 человек, что уже на порядок лучше, чем ПЦР. Если используются все 6 маркеров и их результаты коррелируют между собой, вероятность ошибки исчезающе мала - 3 * 10-7 степени, или 6 ошибок за 10 000 лет. На практике совпадение результатов должно наблюдаться в 2 - 3 - 4 методиках. То есть если положительны суммарные антитела, то в теории должны быть и анти - cor (M или G), а затем и анти - NS (по крайней мере, один из). Из нашего опыта следует, что если определяются антитела к 1 - 2 индивидуальным антигенам, то суммарные антитела зачастую не определяются. Это не обязательно свидетельствует о недостатке тест-систем. Согласно данным японских авторов, имеются мутантные штаммы, при которых антитела в крови не определяются вообще. Аналогичные формы вирусов обнаружены и в США. Кроме того, тест-системы рассчитаны на выявление антител к наиболее иммуногенным специфичным сайтам соответствующих антигенов. Когда, в силу индивидуальных особенностей организма, наиболее иммуногенным признается участок, скажем несколько смещенный от наиболее вероятного, то антитела могут не фиксироваться на многокомпонентных системах, где активные точки могут перекрываться другими молекулами. При этом для большинства других обследуемых, связывание антител происходит без каких-либо проблем. В последнее время мы стали выдавать чаще результаты ИФА, где для тех или иных маркеров указывается значение ±. Должен пояснить, что несмотря на то, что реакция считается качественной, результат получается в виде непрерывной шкалы значений, на которой определяется отсекающий уровень. Все, что находится выше этого уровня, относится к положительным результатам, что ниже - к отрицательным. Однако, если принимать во внимание ошибки дозирующих устройств (около 5 %) и ошибки измерительных приборов (около 10 %), то суммарное отклонение может достигать 15 % от отсекающего уровня, и все значения в этом диапазоне желательно отнести к сомнительным и повторить исследование. В 80 % при этом результаты могут быть однозначно оценены, в 20 % случаев требуется повторное взятие крови.

Несколько замечаний по технической стороне оценки ПЦР. Во-первых, применяемые нами методики качественные. Для по-настоящему полуколичественной ПЦР требуются специальные амплификаторы с возможностью кинетических измерений продуктов реакции. Все остальные варианты с титрованием и фотометрией считаются недостоверными. И даже при наличии специального оборудования реакции считаются полуколичественными, так как на этапе выделения РНК возможны потери генетического материала в ходе неоднократных осаждение и очистки. На выход материала влияет и то обстоятельство, что вирус гепатита С, извлеченный из крови, очень неустойчив во внешней среде и легко разрушается РНКазами, даже находящимися в выдыхаемом воздухе. В течение последнего года у нас имелся двухнедельный период, когда мы не могли выделить РНК вируса гепатита С, при том что РНК вируса клещевого энцефалита в этих же условиях сохранялась полностью. Какую-то роль при этом играло и систематическое применение препарата DNA-erase для обработки помещений и оборудования. Этап выделения РНК, таким образом, является достаточно сложным для стандартизации. Вероятно именно по этой причине обычная ПЦР и “нестед”-ПЦР, которые теоретически должны отличаться по чувствительности в 1000 раз, согласно паспортным данным, отличаются всего в 5 раз. Вероятно, 200 геномов на пробу - это тот предел, ниже которого до этапа амплификации может не дойти ни одного. Важнейшим фактором при этом является наличие генетического материала в пробе, то есть, правильный забор материала важен как и для любой другой методики. Касательно гепатита С, на 10 международном симпозиуме по вирусным гепатитам и заболеваниям печени, проходившем 9 - 13 апреля этого года в г. Атланте, французские ученые Peignoux-Martinot и др. представили результаты наблюдения за 135 пациентами в течение 7 лет. Согласно их данным, у 31 % больных РНК в крови не детектировалась, и за семь лет наблюдения эта ситуация не изменилась. Из этих данных следует, что если положительный результат подтверждает наличие гепатита С почти на 100 %, то отрицательный соответствует истине с вероятностью 1 : 2, что явно недостаточно для постановки диагноза. Если эти данные подтвердятся в дальнейшем, то единственной прерогативой ПЦР будет контроль за проводимой терапией, но не ранняя диагностика. На том же симпозиуме американскими учеными Prince и др. изложены механизмы транспортировки HCV в крови, что дает надежду на скорое появление массовых дешевых тест-систем для определения cor-белка, появление которого в начале заболевания предшествует появлению РНК, а тандем Cor - анти-cor теоретически должен определяться в любое время, независимо от стадии. И, наконец, последняя информация из материалов симпозиума. Американские ученые Yeo A.T. и др. пытались установить зависимость между тяжестью поражения печени и уровнем РНК на основании количественной ПРЦ. Они сделали три вывода:

1. У большинства пациентов (98,4%) имеется нестабильный уровень РНК, меняющийся от измерения к измерению более чем на 1 логарифм.

2. Не существует связи между гистологическим повреждением печени и уровнем РНК, генотипом, полом, расой и возрастом.

3. Наблюдается зависимость между повышенной активностью сывороточной ALT и гистологическим повреждением печени.

Подводя итог вступительной части, можно подчеркнуть, что оценка метода ПЦР является очень неоднозначной, и прежде чем пытаться провести подобную оценку, нам необходимо определиться с тем эталоном, с которым можно сравнить полученные нами результаты. При отсутствии гистологического контроля для нас единственной возможностью верификации гепатита С является только исследование маркеров (спектра антител), при совпадении результатов которой достоверность, как я уже упоминал, очень высока.

К сожалению, из выше упомянутых тысяч обследованных, одновременно исследовать ПЦР и маркеры смогли позволить себе лишь 31 человек, из которых двое исследовали по одному маркеру, а, значит, не удовлетворяют нашим критериям. Таким образом, в качестве референтной группы взята группа из 29 человек, из которых 20 являются истинно положительными и 9 истинно отрицательными. Результаты ПЦР в данных группах обнаруживают 2 ложноположительных и 2 ложноотрицательных результата. Отсюда диагностическая значимость положительных и отрицательных результатов составляет соответственно 92 и 81 %. Учитывая небольшую величину выборки, говорить о достоверности выводов не приходится, хотя явно прослеживается тенденция большей информативности положительных результатов. Не исключено, что на большой выборке эта цифра приблизится к паспортному значению в 98%. Что касается значимости отрицательных результатов, то можно добавить, что в нашей лаборатории проводилось обследование группы лиц с ранее установленным диагнозом гепатита С и процент отрицательных результатов был довольно значительным (до 20 – 30%), причем части из них для подтверждения диагноза была сделана биопсия.

На сегодняшний день метод ПЦР в диагностике гепатита С не является ни панацеей, ни «золотым стандартом». Ему присущи некоторые достоинства и множественные недостатки, проистекающие из этих достоинств. Метод не может быть рекомендован ни для скрининга (особенно в службе крови), ни для ранней диагностики HCV. Он не может заменить ни исследование уровня ALT, ни исследование гистологической картины. В целом это еще один из методов диагностики, позволяющий улучшить диагностику в сложных и неясных случаях.